Élucider les effets du knockout du gène GBA1 et de l’inflammation sur l’ARN d’astrocytes hSPC

Savez-vous que plus de 10 millions de personnes au monde sont atteintes de la maladie de Parkinson et que ce nombre ne fait que monter? En effet, une étude du British Medical Journal estime que, d’ici 2050, le nombre pourrait atteindre près de 25 millions. Cette maladie neurodégénérative est caractérisée par l’accumulation des protéines, alpha-synucléine et tau, dans le cerveau. Le glucosylcéramidase bêta 1, aussi appelé GBA1, est un gène qui contribue normalement à la création d'un enzyme qui travaille dans les lysosomes afin d’éliminer les substances toxiques dans les cellules. Sa mutation est souvent associée au développement de la maladie de Parkinson. C’est un facteur de risque dans 5 à 15% des cas. Cependant, son mécanisme exact dans la formation de cette maladie demeure que partiellement compris même à ce jour. Dans ce projet, un protocole se diverge parallèlement en trois pipelines bioinformatiques pour comparer, l’un à l'autre, trois groupes d’échantillons de séquences ARN hPSC ayant une combinaison de génotype et conditions différentes. L’analyse d’expression différentielle génique, l'enrichissement des résultats par «Gene Ontology» et voies KEGG sont considérés afin d'élucider les effets isolés et combinés de l’inflammation et du knockout du GBA1.

La maladie de Parkinson affecte plus de 10 millions de personnes mondialement [voir fig1, statistiques canadiennes]. D’ici 2050, le nombre est estimé de grimper jusqu’à près de 25 millions dû à plusieurs facteurs (ex: une population vieillissante). Cela veut dire que notre avenir sera bien concerné par sa manifestation et son traitement. Cependant, son mécanisme exact dans son fonctionnement n'est que partiellement compris [fig2] et demeure sans remède. Le développement de cette maladie neurodégénérative est dévastateur.

Pourquoi le GBA1?

La mutation du gène GBA1 est la mutation la plus souvent associée au développement de la maladie de Parkinson. C’est un facteur de risque dans 5-15% des cas. Il contribue normalement à la création d'un enzyme (glucosycéramidase) qui travaille dans les lysosomes afin d’éliminer les substances toxiques dans les cellules. Ses effets sont encore doutés dû à la nature multifactorielle de la MP.

Pourquoi les astrocytes?

Ces cellules forment la majorité du système nerveux central. Elles sont centrées dans la recherche du GBA1, puisque qu'elles sont sensibles à ces changements dans la signature génétique.

L’objectif de cette expérience est:

D'élucider les effets isolés et combinés du silençage du GBA1 et de l’inflammation;

De faire l’analyse différentielle génique d'ARN astrocytes hPSC entre 3 groups d’échantillons;

D'examiner les différences significatives et saturées qu’apporte l’inflammation et le silençage GBA1.

Afin de:

Mieux comprendre le rôle de ce composant génétique, GBA1, sur les processus dans les astrocytes;

Déconstruire la chaîne, inflammation-->a-syn-->inflammation, etc., en cause-->conséquences

Les échantillons [fig1]

Séquençage d'ARN

Proviennent des cellules souches humaines pluripotentes de la lignée cellulaire WT-C11.

La condition de l’inflammation est induite par un traitement ITC (Interleukine 1, TNFa, Complément C1q).

La condition sham reproduit les mêmes manipulations que subissent les autres échantillons, mais sans vrai traitement inflammatoire.

Trois groupes de séquences ARN différentes [fig2]:

Wildtype (sans KO du GBA1) avec une condition sham

KO du gène GBA1 avec une condition sham

KO du GBA1 avec une condition inflammatoire

Variables indépendantes [voir fig3 pour les autres variables]

pipeline 1 (GBA KO + sham vs WT + sham) : KO GBA (génotype)

pipeline 2 (GBA KO + inflammation vs GBA KO + sham): inflammation (condition)

pipeline 3 (GBA KO + inflammation vs WT + sham): KO GBA+ inflammation (génotype & condition)

Délimitation [fig5]

Préparer les données:

1.Importer les échantillons du dataset GSE250182 dans la plateforme Galaxy project.

2.Utiliser MultiQC pour analyser la qualité des séquences.

3.Faire le contrôle de la qualité et la coupe des séquences.

4.Trouver le sens des brins.

5.Aligner des lectures au génome de référence hg38.

6.Faire la quantification: compter et assigner les lectures.

Pipeline 1:

DESeq2:

7.Obtenir la longueur des gènes à partir de hg38

8.Entrer les séquences préparées dans DESeq2 pour acquérir les gènes différentiellement exprimés.

9.Filtrer pour les DEGs les plus significatifs (valeur p<0.05)

10.Filtrer pour les DEGs avec de l’ampleur de plus de 2-fold.

Gene Ontology [fig6]:

11.Annoter les résultats DESeq2 et les utiliser pour obtenir les top 230 catégories GO.

KEGG [fig6]:

12.Utiliser les DEGs ainsi qu’un fichier des ID et longueurs de gènes pour obtenir les statistiques des voies KEGG.

13.Filtrer pour les voies surreprésentées et sous-représentées.

Pipeline 2 & 3:

Répéter les étapes 8 à 13 selon les deux groupes comparés [voir fig4].

Le knockout du GBA a un vaste effet sur l'expression génique, mais l'inflammation amplifie ces changements:

Principal component analysis en résumé [fig1, 2 & 3]:

Les hauts pourcentages présentent un vaste décalage entre les groupes comparés.

Le pipeline 2 présente le plus clair contraste et le pipeline 1 le plus bas pourcentage.

Une même proportion d'écart est observé dans les diagrammes distance échantillon-échantillon [fig4, 5 & 6].

Gènes différentiellement exprimés (DEGs)

1. Génotype [fig7]

Ce nombre (DEGs) indique que seul le silençage du GBA1 peut avoir des impacts importants sur les gènes exprimés.

2. Condition [fig8]

Les grandes quantités de DEGs démontrent une sensibilité à l’inflammation.

Il y a beaucoup de DEGs significatifs, mais pas un aussi grand % de DEGs avec de l’ampleur importante (moins de DEGs pouvant passer le deuxième filtre).

3. Génotype & condition [fig9]

La quantité de DEGs est presque triplée comparativement à pipeline 1. Il porte le nombre de lignes significatives le plus élevé.

Moins de DEGs considérés significatifs, mais plus de DEGs pouvant passer le deuxième filtre avec de l’ampleur.

Comparaisons des résultats DEGs

Le génotype & la condition ont le plus grand nombre de DEGs totaux, mais la condition à un nombre supérieur de DEGs significatif avec de l’ampleur.

Ces résultats correspondent à l’écart de la valeur PC1.

Gene Ontology

Valeurs-p:

Toutes les valeurs-p ajustées présentent une ampleur très importante que ce soit entre 0,00000002-0,00000006, 3.644510x10^25-1,864430x10^56 ou 0.000000004-0.000000016. Ça confirme que les résultats sont significatifs.

1. Génotype [fig10]

Nous pouvons regrouper les GO en quelques catégories dénominatives:

-->Neuro-développement;

-->Liaison à l’ADN et la régulation de transcription;

-->Développement du système

Forts indicateurs vers la dérégulation des systèmes neurodéveloppementaux & régulatoires de transcription.

2. Condition [fig12]

Les regroupements sont:

-->Organisation;

-->Régulation de la communication cellulaire;

-->Développement: anatomique & multicellulaire;

-->Liaison aux protéines

Indique changements dans le fonctionnement fondamentaux des systèmes et, non seulement, neurologiques.

3. Génotype & condition [fig17]

Nous pouvons regrouper les GO en quelques catégories:

-->Cycle cellulaire mitotique;

-->Réplication de l’ADN;

-->Liaison à l’ADN;

-->Développement du système

Cycle cellulaire irrégulièrement pertubé.

Signes de prolifération, cycle cellulaire changé & stress cellulaire.

Les voies KEGG

1. Génotype

Il n’y a que la voie, guidage axonal [fig11] significativement surreprésentée Elle s'implique dans la formation de réseaux neuronaux.

-->Connexion logique avec le tableau GO & indication de la dérégulation des systèmes neurodéveloppementaux.

2. Condition

Beaucoup plus de voies KEGGs sont surreprésentées, mais elles peuvent être regroupées en quelques catégories:

-Maladies neurodégénératives; cancers; en rapport avec les cancers; infections;

-et autres:

Protéasome [fig16]

-->Toutes cases sont régulées à la baisse

-->Signe de dysfonction lysosomal.

Cycle cellulaire [fig14]

-->Mélange de cases régulées à la baisse & hausse.

Apoptose [fig13]

-->Voies de signalisations majoritairement régulées à la baisse.

-->Mélange baisse/hausse pro-apoptose versus pro-survie.

Phosphorylation oxydative [fig15]

Signalisation

Les voies sont majoritairement liées à des processus du stress cellulaire & de la mort cellulaire plutôt qu’à des voies uniquement inflammatoires.

3. Génotype & condition

Moins de voies KEGGs surreprésentées:

Replication ADN [fig19]:

-->Toutes cases sont régulées à la hausse

-->Signe de prolifération

Biosynthèse des stéroïdes [fig18]:

-->Majoritairement régulé à baisse

En conclusion:

Le GBA seul peut reprogrammer la signature génique, surtout auprès des systèmes neurodéveloppementaux et la transcription. Il n’est, cependant, pas autant influent que l’inflammation: il y a moins de DEGs, des valeurs-p supérieures (comparativement), moins de voies KEGGs surreprésentées, etc.

L’inflammation isolée, dans un génotype knockout du GBA1, porte le plus grand et amples (considérant le nombre de voies KEGGs, et sa valeur-p) changements significatifs.

Même avec cette inflammation, au lieu de voies uniquement inflammatoires, on voit plutôt des voies du stress cellulaire et de la mort cellulaire.

Knockout du GBA + inflammation: Il y a des signes de prolifération supportés par les résultats qui comportent de multiples de ses caractérisants. Notamment, la réplication de l'ADN est majoritairement régulée à la hausse et le cycle cellulaire mitotique forme les tops catégories Gene Ontology.

La contribution des résultats aux futurs approfondissements:

Discerner la différence d’ampleur entre les causes (génétiques), les aggravants & les conséquences (inflammation) dans la maladie de Parkinson;

Développer une meilleure façon de mesurer la progression de cette maladie par la compréhension des impacts individuels du GBA1 & de l’inflammation;

Défricher le rôle du GBA1 dans le cycle, inflammation-->Parkinson-->inflammation;

Trouver des biomarqueurs génothérapeutiques.

Limitations et amélioration:

Obtenir une plus grande quantité d’échantillons pour peaufiner la précision des résultats sur une plus vaste échelle.

Compléter le protocole en carré factoriel: ajouter un quatrième pipeline qui compare WT+inflammation sur WT+sham par mesure d'élaborer les effets de l'inflammation sur l'ARN d'astrocytes sans silençage du GBA1.

Utiliser un langage de code comme Python ou Java afin d’avoir un plus grand contrôle sur les paramètres du protocole.

Mettre en action les résultats vers l'identification des changements dans des échantillons étrangers (développer vers le dépistage de la MP).

J’aimerais remercier Dr. Anqi Huang de Francis Crick Research Institut pour avoir pris le temps de guider et réviser mes conclusions.

Un grand remerciement à Dr. Robert Krencik de Houston Methodist qui m’a généreusement donné la permission d’utiliser sa collection de données de séquences pour mon projet en plus d’avoir partager ses recherches déjà entreprises à ce sujet.

Merci à Jonathan Chan et puis l’équipe à GVRSF pour leur support et leurs conseils infinis au cours du développement de ce projet.

Merci à ma famille qui m'a aidé à relire et imprimer mes milliers de documents en plus de les corriger.

Finalement à mon amie, Nara, merci de m'avoir fait découvrir les expos-sciences!

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